دیدگاه کلی
فهرست مطالب
متداول ترین روش مطالعه بافت ها، آماده سازی مقاطع بافتی به نحوی است که قابل مطالعه با میکروسکوپ نوری باشند. در زیر میکروسکوپ نوری، بافت ها به وسیله پرتویی که از درون بافت عبور داده می شود، مورد بررسی قرار می گیرند. از آنجا که معمولا اندام ها و بافت ها آنقدر ضخیم هستند که نور نمیتواند از آن عبور کند، باید برای به دست آوردن مقاطع نازک و شفاف برش داده شوند.
یک آماده سازی میکروسکوپی ایده آل باید طوری نگه داری شود، که روی لام همان ساختمان و ترکیب و مولکولی را که در بدن دارا بوده است، نشان دهد. این کار به ندرت امکان پذیراست، زیرا فرایند آماده سازی باعث از بین رفتن لیپید سلولی و بهم ریختگی ساختار سلول می شود.
ثابت سازی (Fixation)
برای حفظ ساختار بافت و جلوگیری از تخریب بافت توسط آنزیم های رها شده از سلول ها و موجودات میکروسکوپی، قطعات مناسب از اعضا باید بلافاصله بعد از بیرون آوردن از بدن، در محلول های ثبوت یا در ترکیباتی که ایجاد اتصال متقاطع می کنند و فیکساتیو نامیده می شوند، غوطه ور گردند. از آنجا که فیکساتیو باید کاملا به درون بافت ها نفوذ کند، بافت ها معمولا قبل از روند ثابت سازی به قطعات کوچکی بریده می شوند تا فیکساتیو به راحتی نفوذ کند و حفظ بافت تضمین شود. برای حفظ سلول ها در ارگان های بزرگ معمولا تزریق داخل عروقی فیکساتیو نیز می تواند مورد استفاده قرار گیرد. دز این حالت ماده فیکاستیو به سرعت از طریق عروق خونی به بافت ها می رسد.
یکی از بهترین فیکساتیو ها برای مطالعه با میکروسکوپ نوری، فرمالین است که یک محلول ایزوتونیک بافر شده فرمالدئید ۳۷ درصد است. هردو فیکساتیو فرمالدئید و گلوتارآلدئید (فیکساتیو دیگری که غالبا برای مطالعه میکروسکوپ الکترونی کاربرد دارد)، با گروه های آمینی (NH۲) پروتئین های بافتی واکنش نشان می دهند و از تجزیه آنها توسط پروتئاز ها جلوگیری می کنند. با توجه به اینکه گلوتارآلدئید می تواند در پروتئین ها اتصال متقاطع ایجاد نماید، ساختار سلول ها و ECM به خوبی حفظ می شود.
با توجه به قدرت تفکیک۱ زیاد میکروسکوپ الکترونی، برای حفظ جرئیات بسیار ریز فراساختاری۲ دقت بیشتری در فیکساسیون لازم است. به این منظور، بافت فیکس شده با گلوتارآلدئید در تتراکسید اسمیوم بافر شده، غوطه ور شده و تتراکسید اسمیوم سبب حفظ (و رنگ آمیزی) چربی ها و پروتئین های سلولی می شود.
قالب گیری و مقطع گیری (Embedding and Sectioning)
جهت تهیه مقاطع نازک، بافت ها بایستی پس از ثابت سازی، تحت نفوذ۳ با مواد قالب گیری قرار گیرند تا قوام سخت پیدا کنند. مواد قالب گیری، پارافین و رزین های پلاستیکی هستند. پارافین به طور معمول برای میکروسکوپ نوری به کار می رود و رزین ها در مطالعات با میکروسکوپ نوری و الکترونی کاربرد دارند.
قبل از نفوذ از مواد قالب گیری، بافت فیکس شده باید تحت آبگیری۴ قرار گیرد. در آبگیری، آب از قطعات فیکس شده با شستشوی پی در پی آنها در محلول های افزایشی اتانول (تا ۱۰۰ درصد) خارج می گردد. سپس یک حلال با قابلیت مخلوط شدن با الکل و ماده قالب گیری، جایگزین اتانول می شود. به این فرایند شفاف سازی می گویند. زیرا نفوذ با معرف های مورد استفاده در اینجا ظاهری شفاف به بافت می بخشد.
بافت کاملا شفاف شده سپس در درون پارافین مایع در داخل اون با دمای ۵۲-۶۰ درجه قرار می گیرد. گرما سبب تبخیر حلال می شود و فضای داخل بافت ها توسط پارافین مایع پر می شود. بافت همراه با پارافین موجود در آن پس از خروج از اون در در دمای اتاق سفت می شود. بافت هایی که با رزین پلاستیکی قالب گیری می شوند نیز در اتانول آبگیری شده و با حلال های پلاستیکی که با اضافه شدن پلی مراز های با پیوند متقاطع سخت می شوند، تحت نفوذ قرار می گیرند. قالب گیری با پلاستیک از چروکیدگی و به هم ریختگی بافت، که در نتیجه حرارت زیاد لازم برای قالب گیری با پارافین استفاده می شود، جلوگیری می کند.
قالب های سخت حاوی بافت و پارافین اطراف آن برای مقطع گیری در دستگاهی قرار می گیرد که میکروتوم نامیده می شود. به طور معمول برای مطالعه با میکروسکوپ نوری بافت به قطعاتی با ضخامت ۳ تا ۱۰ میکرومتر بریده می شود. درحالیکه برای مطالعه با میکروسکوپ الکترونی مقاطعی با ضخامت کمتر از ۱μm ایجاد می شود. یک میکرومتر برابر با ۰/۰۰۱ میلی متر و ۶-۱۰ متر است. یک نانومتر برابر با ۰/۰۰۱ میکرومتر، ۶-۱۰ میلی متر و ۹-۱۰ متر می باشد. هر انگستروم ۰/۱ نانومتر (۴-۱۰ میکرون) است. مقاطعی بسیار نازک که تهیه شده اند برای رنگ آمیزی بر روی لام های شیشه ای جهت مطالعه با میکروسکوپ نوری منتقل می شوند و یا روس گرید های فلزی مخصوص برای میکروسکوپ الکترونی جهت رنگ آمیزی و مطالعه منتقل می گردند.
رنگ آمیزی (Staining)
بسیاری از سلول ها و مواد خارج سلولی به طور کامل فاقد رنگ هستند و بیشتر مقاطع جهت مطالعه میکروسکوپی باید رنگ آمیزی شوند. بنابراین، روش های رنگ آمیزی بافت ها ابداع شده اند که نه تنها اجزای مختلف بافتی را مرئی می کنند، بلکه افتراق ایت اجزا را نیز میسر می نمایند. رنگ ها اجزای بافتی را کم و بیش به طور انتخابی رنگ می کنندو اغلب رنگ های مصرفی مانند ترکیبات اسیدی یا بازی رفتار می کنند و تمایل دارند که پیوند های الکترواستاتیک (نمکی) با رادیکال های یونیزه شونده ماکرومولکول ها در بافت ها تشکیل دهند. اجزای سلولی مثل اسید های نوکلئیک که دارای بار منفی (آنیونی) هستند با رنگ های قلیایی راحت تر رنگ می گیرند و بازوفیل نام دارند در حالیکه اجزا کاتیونی مانند پروتئین ها که دارای تعداد زیادی گروه های آمینی یونیزه می باشند، تمایل به رنگ های اسیدی دارند و اسیدوفیل نامیده می شوند.
تولوئیدن بلو۵، آلسین بلو و متیلن بلو، مثال هایی از رنگ های قلیایی هستند. هماتوکسلین به صورت یک رنگ قلیایی رفتار می کند، یعنی اجزای بافتی بازوفیل را رنگ می کند. اجزای اصلی بافتی که یونیزه می شوند و با رنگ های قلیایی واکنش می دهند، به دلیل وجود اسید ها در ساختمان آنها چنین واکنشی دارند (RNA، DNA، کلیگوزآمینوگلیکان ها). رنگ های اسیدی مثل نارنجی جی۶ ائوزین۷ و فوشین اسیدی۸، اجزای اسیدوفیل بافت ها مانند میتوکندری، گرانول های ترشحی و کلاژن را رنگ می کنند.
از میان همه رنگ ها، ترکیب هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) کاربرد بیشتری دارد. هماتوکسیلین، رنگ آبی تیره یا بنفش ایجاد می کند و DNA در هسته سلول، بخش های غنی از RNA سیتوپلاسم و ماتریکس غضروف را آبی، تیره یا بنفش می کند. در مقابل، ائوزین سایر ساختار های سیتوپلاسمی و کلاژن را به رنگ صورتی در می آورد. در اینجا ائوزین به عنوان پادرنگ در نظر گرفته می شود. پادرنگ به رنگی گفته می شود که به صورت جداگانه و برای افتراق قسمت های دیگر بافت استفاده می شود. زنگ آمیزی های پیچیده تر، از جمله زنگ های تری کروم (برای مثال، تری کروم سامون) اجازه افتراق بیشتری را در بین اجزای خارج سلولی بافت می دهند.
واکنش پریودیک اسید-شیف (PAS) از حلقه های هگزوز پلی ساکارید ها و دیگر ساختار های غنی از کربوهیدارت بافت استفاده کرده و این ماکرومولکول ها را به رنگ بنفش یا قرمز، رنگ آمیزی می کند. DNA هسته سلول ها می تواند به طور اختصاصی توسط روش های اصلاح شده از رنگ PAS به نام واکنش فولگن۹، رنگ آمیزی شود.
مواد بازوفیلی یا PAS مثبت را می توان با هضم آنزیمی یک مقطع بافتی توسط یک آنزیم خاص که یک سوبسترای خاص را هضم می کند، تشخیص داد. برای مثال استفاده از ریبونوکلئاز باعث می شود که مقدار بازوفیلی سیتوپلاسم تا حدود زیادی کاهش یابد و یک اثر جزئی نیز روی هسته دارد که نشان دهنده اهمیت RNA در رنگ آمیزی سیتوپلاسم می باشد.
ساختار های غنی از چربی سلول ها، با انجام ندادن مراحل از بین برنده چربی ها قابل شناسایی می باشند، مانند استفاده از گرما، حلال های آلی و رنگ آمیزی با رنگ های محلول در چربی مانند سودان سیاه که می تواند در تشخیص بیماری های متابولیکی که مرتبط با تجمع کلسترول، فسفولیپید و گلیکولیپید باشند، مفید واقع شود. علاوه بر رنگ آمیزی بافت ها توسط رنگ، تکنیک های تلقیح فلز نیز استفاده می شود. به طور معمول از نمک های نقره برای شناسایی الیاف ماتریکس خارج سلولی و عناصر سلولی ویژه در بافت عصبی استفاده می شود.
کل فرایند از فیکساسیون تا مشاهده یک بافت زیر میکروسکوپ نوری، بسته به اندازه بافت، محیط قالب گیری، و روش رنگ آمیزی می تواند ۱۲ ساعت تا ۲/۵ روز طول بکشد. مرحله آخر قبل از مشاهده کردن لام، چسباندن لامل با یک چسب شفاف روی لام می باشد.
- Resolution ↩︎
- Ultrastructure ↩︎
- Infiltration ↩︎
- Dehydration ↩︎
- Toluidin blue ↩︎
- Orange G ↩︎
- Eosin ↩︎
- Acid fuchin ↩︎
- Feulgen ↩︎