میکروسکوپ نوری
فهرست مطالب
میکروسکوپ های زمینه روشن معمولی و نیز میکروسکوپ های تخصصی مانند فلورسنت، فاز کنتراست، پلاریزان و هم کانون، همگی براساس تعامل بین نور و اجزای بافت کار می کنند و می توان برای مطالعه بافت ها از آنها استفاده نمود.
میکروسکوپ زمینه روشن
در میکروسکوپ زمینه روشن نمونه های رنگ شده معمولا بر اساس میزان نوری که از درون بافت عبور می کند، بررسی می شوند. این میکروسکوپ شامل یک سیستم نوری و مکانیسم هایی برای حرکت و متمرکز کردن نمونه می باشد. اجزای نوری متشکل از سه سیستم عصبی هستند. متراکم کننده (Condenser) نور را جمع و روی نمونه مورد مطالعه متمرکز می کند، عدسی شیئی که شیء را برزگ می کند و آن را در امتداد قطعه چشمی قرار می دهد. قطعه چشمی یا عدسی چشمی تصویر را بزرگتر کرده و آن را بر روی شبکیه فر مشاهده کننده یا بر روی وسیله ای که با صفحه ای شارژی جفت شده است (CCD) و به شدت به مقادیر بسیار کم نور حساس است و با یک مانیتور و دوربین همراه است، منعکس می کند. بزرگنمایی کلی میکروسکوپ نوری با ضرب کردن قدرت بزگنمایی عدسی های شیئی در هم، به دست می آید.
عامل اساسی در بدست آوردن یک تصویر واضح و دقیق با میکروسکوپ، قدرت تفکیک است که عبارت است از کمترین فاصله بین دو شیء کوچک است که در آن فاصله، به صورت اشیای مجزا قابل مشاهده باشند. بالاترین قدرت تفکیک میکروسکوپ نوری تقریبا ۰/۲ میکرومتر است، این قدرت تفکیک تصاویر خوبی ایجاد می کند که ۱۰۰۰ تا ۱۵۰۰ برابر بزرگ شده اند. اجزای کوچک تر از ۰/۲ میکرومتر (مانند یک ریبوزوم، یا میکروفیلامان سیتوپلاسمی) را نمی توان با این ابزار تشخیص داد. به طریق مشابه، دو شیء مانند میتوکندری اگر فاصله ای کمتر از ۰/۲ میکرومتر داشته باشند، به صورت یک شیء واحد دیده می شوند. کیفیت تصویر، وضوح و میزان نمایش جزئیات، به قدرت تفکیک میکروسکوپ و قدرت تفکیک به طور عمده به کیفیت عدسی شیئی بستگی دارد. بزرگنمایی فقط زمانی با ارزش است که همراه با قدرت تفکیک بالا باشد. عدسی های شیئی با بزرگنمایی بالاتر دارای قدرت تفکیک بیشتری نیز هستند. عدسی چشمی فقط تصویر حاصل از عدسی شیئی را بزرگ می کند و قادر به بهبود و قدرت تفکیک نیست.
میکروسکوپ مجازی که به طور معمول برای مطالعه، بافت ها با زمینه روشن استفاده می شود، شامل تبدیل مقطع بافتی آماده به تصاویر دیجیتالی با کیفیت بالاست و این اجازه را می دهد که بدون وجود نمونه رنگ آمیزی شده یا میکروسکوپ و با استفاده از کامپیوتر یا لوازم دیجیتالی دیگر، بافت ها را مطالعه نمود. در این تکنیک، به وسیله میکروسکوپ مخصوصی از نواحی مختلف نمونه قرار گرفته روی لام تصویر برداری می شود. این کار با بزرگنمایی های مختلف تکرار شده و در نهایت هزاران فایل تصویری پشت سر هم ذخیره می کند که قابلیت دسترسی، مشاهده و دستیابی به اسلاید اصلی را از طریق مرور گر های رایج وب و سایر دستگاه ها فراهم می کند. میکروسکوپ های مجازی با هزینه کمتر و استفاده راحت تر، به سرعت جایگزین میکروسکوپ های نوری و مجموعه های اسلاید در آزمایشگاه های بافت شناسی می شوند.
میکروسکوپ فلورسنت (Fluorescence Microscopy)
برخی از اجزای سلول وقتی تحت تابش نور با یک طول موج مشخص قرار می گیرند، نوری با طول موج بلندتر ساطع می کنند. این پدیده فلورسانس نام دارد. در روش مطالعه با میکروسکوپ فلورسنت، مقاطع بافتی تحت تابش نور ماوراء بنفش (UV) قرار می گیرند، و نور ساطع شده از آنها در بخش قابل رؤیت طبف نوری قرار می گیرد. مواد فلورسنت به صورت درخشان در یک زمینه تاریک دیده می شوند. در این روش، میکروسکوپ دارای یک منبع نور UV قوی و فیلتر های خاص می باشد که اشعه ساطع شده از اجسام با طول موج های مختلف را برای تشکیل تصویر انتخاب می کند.
ترکیبات فلورسنت که تمایل به اتصال با ماکرومولکول های خاصی از سلول دارند، می توانند به عنوان رنگ های فلورسنت مورد استفاده قرار گیرند. به عنوان مثال، آکریدین نارنجی۱ که می تواند با DNA و RNA ترکیب شود، در ترکیب با این اسید های نوکلئیک، اشعه های مختلفی را ساطع می کند. بدین ترتیب شناسایی و تعیین موقعیت اسید های نوکلئیک در سلول ها امکان پذیر است. سایر ترکیبات مانند هوخست۲ و DAPI به طور اختصاصی به DNA متصل می شوند و برای رنگ آمیزی هسته کاربرد دارند که در زیر نور UV به رنگ آبی دیده می شوند. یک کاربرد مهم دیگر میکروسکوپ فلورسنت، الحاق موادی نظیر فلوئورسین به مولکول هایی است که به طور اختصاصی به اجزای بافت ها اتصال خواهند یافت و بدین ترتیب امکان شناسایی این اجزا را در زیر میکروسکوپ فراهم خواهند کرد. آنتی بادی های نشان دار شده با ترکیبات فلورسنت در رنگ آمیزی های ایمونوهسیتولوژیک کاربرد زیادی دارند.
میکروسکوپ فاز کنتراست (Phase-Contrast Microscopy)
سلول ها و مقاطع بافتی رنگ آمیزی نشده که معمولا شفاف و بی رنگ می باشند، قابل مطالعه با این میکروسکوپ نوری تغییر یافته هستند. جزئیات سلولی در بافت های رنگ نشده به سختی قابل رؤیت هستند، زیرا دارای چگالی نوری۳ یکسان می باشند. در مطالعه با میکروسکوپ فاز کنتراست، از عدسی هایی استفاده می شود که از اشیای شفاف، تصاویر قابل رؤیت می سازند و برای مشاهده سلول های زنده کشت داده شده مناسب هستند.
مطالعه با میکروسکوپ فاز کنتراست بر این اصل استوار است که سرعت نور هنگام عبور از ساختمان های سلولی و خارج سلولی با ضرایب انکسار مختلف، تغییر می کند. این تغییرات توسط دستگاه فاز کنتراست استفاده می شود تا ساختمان ها نسبت به یکدیگر روشن تر یا تیره تر به نظر برسند. از آنجایی که در این روش نیازی به فیکساسیون و رنگ آمیزی نیست، این نوع میکروسکوپ بزاری قدرتمند جهت استفاده در آزمایشگاه های کشت سلول می باشد. روش دیگر برای مشاهده سلول ها یا مقاطع بافتی رنگ آمیزی نشده مطالعه با میکروسکوپ با تداخل افتراقی نومارسکی است که یک تصویر سه بعدی از سلول های زنده ایجاد می کند.
میکروسکوپ هم کانون
میکروسکوپ نوری زمینه روشن، دارای پرتو نور نسبتا بلند بوده و نمونه را پر می کند. انحراف نور موجب کاهش کنتراست تصویر و قدرت تفکیک عدسی شیئی می شود. میکروسکوپ هم کانون با استفاده از دو اصل، مانع از این مشکل شده موجب می شود وضوح تصویر بهتر شود. این دو اصل عبارتند از: ۱-استفاده از یک نقطه کوچک نوری با شدت بالا که توسط یک لیزر ایجاد می شود. ۲-استفاده از یک صفحه با یک منفذ بسیار کوچک که در جلوی آشکار ساز تصویر قرار گرفته است. منبع نوری نقطه ای، کانون عدسی و منفذ آشکار ساز تصویر با هم در یک راستا قرار دارند، بنابراین نور متمرکز نشده عبور نمی کند. این عامل موجب می شود تا وضوح شیء در فوکوس بهبود پیدا کرده در نتیجه اجزای نمونه با دقت بیشتری نسبت به میکروسکوپ نوری قابل مشاهده شود.
میکروسکوپ های هم کانون دارای یک سیستم آینه ای کامپیوتری (پخش کننده پرتو) می باشند که از طریق آن نقطه تابش در طول نمونه به صورت اتوماتیک و با سرعت منتقل می شود. تصاویر دیجیتال از نقاط بسیاری گرفته شده و در یک مقطع نوری در آن صفحه بسیار نازک قابل رؤیت هستند. پس لایه های کانونی مختلف یک نمونه به هم پیوسته و به صورت یک تصویر سه بعدی بازسازی می شوند.
میکروسکوپ پلاریزان (Polarizing Microscopy)
میکروسکوپ پلاریزان امکان تشخیص ساختمان های رنگ شده یا رنگ نشده را فراهم می کند که از مولکول های کاملا سازمان یافته تشکیل شده اند. وقتی نور معمولی از درون فیلتر پلاریزه کننده می گذرد، در هنگام خروج فقط در یک جهت ارتعاش می یابد. اگر فیلتر دومی بالای فیلتر اول قرار داده شود که محور اصلی آن عمود بر محور فیلتر اول باشد، نوری از دستگاه عبور نمی کند. ولی اگر ساختمان های بافتی حاوی ماکرومولکول های جهت دار بین دو فیلتر پلاریزه کننده قرار داده شوند، ساختمان مولکول جهت دار تکرار شونده آنها، محور نور خارج شده از فلیتر پولازیره کننده را می چرخاند. در نتیجه، به صورت ساختمان های روشنی در یک زمینه تیره دیده می شوند. توانایی چرخاندن جهت ارتعاش نور پلاریزه، خاصیت انکسار مضاعف۴ نامیده می شود و یکی از ویژگی های مواد بلوری یا مواد حاوی مولکول های به شدت جهت دار مثل سلولز، کلاژن، میکروتوبول ها و فیللامان های اکتین می باشد.
کاربرد تمامی انواع میکروسکوپ نوری در پی استفاده از دوربین های دیجیتال به شدت توسعه یافته است. نرم افزار مناسب می تواند تصاویر دیجیتال را به صورت کمی تجزیه و تحلیل کند. به علاوه، چنین تصاویری اجازه می دهند بخش هایی که مستقیما به عدسی چشمی قابل رؤیت نیستند، بر روی یک مانیتور دیده می شوند.
میکروسکوپ الکترونی
میکروسکوپ های الکترونی عبوری و نگاره بر اساس تاثیر متقابل پرتو های الکترون ها و اجزاء بافت کار می کنند. طول موج پرتو الکترون بسیار کمتر از نور می باشد و موجب می شود ۱۰۰۰ مرتبه وضوح بهتری از تصویر ارائه دهد.
میکروسکوپ الکترونی عبوری (Transmission Electron Microscopy)
میکروسکوپ الکترون عبوری (TEM) یک سیستم تصویر ساز است که قدرت تفکیکی در حدود ۳nm را مهیا می کند. این قدرت تفکیک بالا امکان آن را فراهم می کند که جزئیات تصویر با بزرگنمایی تا ۴۰۰۰۰۰ برابر دیده شوند. جزئیات مقاطع بافتی بسیار نازک (۹۰-۴۰nm) را می توان تا بزرگنمایی ۱۲۰۰۰۰ برابر با TEM مشاهده کرد.
اجزای یک TEM و اصول پایه عملکرد آن بدین صورت است: پرتویی از الکترون توسط عدسی های الکترومغناطیسی متمرکز شده و از مقطع بافتی عبور می کنند تا تصویری با نواحی سیاه، سفید و خاکستری (بینابینی) را تشکیل دهند. تصویر میکروسکوپ الکترونی در برخی نواحی که الکترون ها به آسانی عبور می کنند، روشن تر (الکترون لوسنت) و در نواحی که الکترون ها جذب یا منحرف شده اند، تیره تر (الکترون دنس) است.
جهت بهبود قدرت تفکیک و وضوح در TEM، ترکیباتی از یون های فلزات سنگین در فرایند آماده سازی بافت به فیکساتیو یا محلول های آبگیری اضافه می شود. این ترکیبات شامل تتراکسید اسمیوم، سیترات سرب و اورانیل است که به ماکرومولکول های سلولی متصل شده و تراکم الکترونی و قابلیت مشاهده آنها را بالا می برند.
شکست انجمادی و فریز کردن تکنیک هایی هستند که مطالعه سلول ها توسط TEM را بدون نیاز به فیکس و قالب گیری مهیا می سازند. در این روش ها نمونه های بافتی بسیار کوچک به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شده و توسط یک چاقو بریده یا شکسته می شوند. سطح بافت توسط یک پوشش نازک، پلاتینیوم یا دیگر اتم های فلزی پوشیده می شود. سپس پوشش ساخته شده، بعد از حذف مواد آلی توسط TEM مورد ارزیابی قرار می گیرد. مقاطع به صورت تصادفی گرفته می شوند و ممکن است دو لایه لیپیدی را از هم جدا کنند و اجزاء پروتئینی غشاء که مطالعه آنها از لحاظ شکل، اندازه و توزیع با روش های دیگر مشکل است، نمایان می شوند.
میکروسکوپ الکترونی نگاره (Scanning Electron Microscopy)
میکروسکوپ الکترونی نگاه (SEM)، نمایی با رزولوشن بالا از سطوح سلول ها، بافت ها و ارگان ها ایجاد می کند. این میرسکوپ الکترونی مانند TEM یک پرتو خیلی باریک از الکترون ها را تولید و متمرکز می کند. الکترون ها در میکروسکوپ الکترونی نگاره از درون نمونه عبور نمی کنند. در عوض سطح نمونه بافتی، خشک شده و با یک لایه خیلی نازک از فلز سنگین (غالبا طلا) پوشانده می شود تا الکترون ها از نمونه منعکس شوند. الکترون های بازتاب شده به وسیله یک آشکار ساز۵ گرفته می شوند و سیگنال های تولید شده مورد پردازش قرار گرفته، یک تصویر سیاه و سفید به وجود می آید. تصاویر SEM به راحتی قابل تفسیر هستند، زیرا نمایی سه بعدی را ارائه می کنند که درست مانند اشیاء بزرگ با سایه روشن های ناشی از نور، دیده می شوند.
اتورادیوگرافی
اتورادیوگرافی میکروسکوپی یک روش برای مکان یابی ماکرومولکول های تازه تولید شده در مقاطع بافتی و یا سلول ها می باشد. متابولیت های نشان دار شده با ماده رادیواکتیو مانند نوکلئوتید ها و اسید های آمینه و قند ها که در ساختار ماکرومولکول های ویژه سلول های زنده (DNA، RNA، پروتئین و گلیکوپروتئین و پلی ساکارید) شرکت دارند، در مکان های خاصی که این ماکرومولکول ها وجود دارند، ایجاد تشعشع می کنند. سلول ها و یا مقاطع بافتی نشان دار شده با مواد رادیواکتیو در یک محیط تاریک با امولسیون های فوتوگراف که حاوی کریستال های برومید نقره هستند، آغشته می شوند. بلور های برومید نقره موجود در امولسیون به صورت آشکار ساز های کوچک۶ عمل می کنند، یعنی با همان روشی که در فیلم عکاسی معمولی نسبت به نور واکنش نشان می دهند. پس از طی زمان کافی برای قرار گیری در معرض ماده مورد نظر در جعبه ضد نور اسلاید ها مشابه روش عکاسی ظاهر و بررسی می شوند. هنگامی که بلور های برومید نقره موجود در امولسیون عکاسی تحت برخورد پرتو ها قرار گیرند، به گرانول های سیاه کوچکی از فلز نقره تبدیل می شوند و بدین ترتیب وجود فعالیت رادیواکتیو را در بافت مشخص می کنند. از این روش می توان در مطالعه با میکروسکوپ الکترونی و نوری هردو استفاده کرد.
اطلاعات فراوانی با استفاده از اتورادیوگرافی، در دسترس قرار می گیرند. اگر یک پیش ساز رادیواکتیو DNA (مانند تیمیدین نشان دار شده با تریتیوم) مورد استفاده قرار گیرد، می توان متوجه شد کدام سلول ها در یک بافت (و چه تعداد از آنها)، در حال همانندسازی DNA و آماده شدن برای تقسیم هستند. وقایع دینامیک نیز می توانند مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرند. برای مثال، جهت تعیین آنکه پروتئین ترشحی در کجای سلول تولید می شود و پیش از ترشح چه مسیری را در سلول طی می کند، یک آمینواسید رادیواکتیو به چند جانور تزریق می شود و مقاطع بافتی در زمان های مختلف پس از تزریق جمع آوری می شوند. اتورادیوگراف های مقاطع، که در فاصله زمان های مختلف تهیه شده اند، روند مهاجرت پروتئین های رادیواکتیو را نشان می دهند.