روش PCR
فهرست مطالب
۱PCR فرایندی مشابه همانندسازی است که در شرایط آزمایشگاه انجام می شود. واکنش زنجیره ای پلیمرازی یا PCR به ما اجازه می دهد تا توالی مورد نظر خود را به صورت انتخابی افزایش داده و میلیون ها برابر آن را، ظرف چند ساعت تولید کنیم. دستگاه PCR برای اولین بار در سال توسط آقای کری مولیس در سال ۱۹۸۵ ارائه شد.
مواد لازم برای انجام PCR
- الگو: قطعه یا قطعاتی از DNA است که به عنوان نمونه استفاده می شود.
- آب و یا بافر: بافر سبب می شود تا PH ثابت مانده و واکنش به صورت ایده آل انجام شود.
- نوکلئوتید: شامل A,T,C,G می باشد.
- پرایمر: پرایمر های مورد استفاده در PCR قطعات کوتاهی (معمولا ۲۰ نوکلئوتیدی) از جنش DNA تک رشته ای می باشند که به نواحی خاصی از توالی مورد نظر متصل می شوند.
- آنزیم DNA پلیمراز: آنزیم پلیمرازی که در PCR استفاده می شود از یک باکتری گرما دوست۲ به نام ترموس آکواتیکوس۳ استخراج شده است. به این آنزیم Taq پلیمراز نیز می گویند. آنزیم Taq پلیمراز مقاومت زیادی به حرارت های بالای PCR دارد.
- کلرید منزیم (MgCl۲): به عنوان یک کوفاکتور در پیشبرد PCR عمل می کند. MgCl۲ در تحریک فعالیت Taq پلیمراز و افزایش دمای ذوب (Tm) و غیره ایفای نقش می کند. نکته مهم این است که باید غلظت کلرید منیزیم در حد مناسب۴ باشد. اگر مقدارش کم باشد، میزان تکثیر افت خواهد کرد و اگر بیش از حد اپتیمم باشد، محصول غیراختصاصی تولید می شود.
مراحل PCR
سه نوع واکنش مهم و کلیدی در PCR به وقوع می پیوندد. این سه نوع واکنش در داخل یک لوله اما در درجه حرارت های مختلف اتفاق می افتد و شامل مراحل ذیل می باشد:
- Denaturation
- Anneling
- Extention
- جدا شدن دو زنجیره DNA (دناتوراسیون): در مرحله اول دو زنجیره از هم جدا و DNA تک رشته ای ایجاد می گردد. آن عمل به واسطه حرارت بالا (°۹۵) و به مدت ۳۰ ثانیه انجام می شود (در واقع در PCR، حرارت نقش آنزیم هلیکاز را انجام می دهد.
- اتصال پرایمر به زنجیره DNA (آنلینگ): برای اتصال پرایمر به ناحیه مکمل در DNA، دمای لوله کاهش داده می شود (به پایین تر از °۵۰-°۶۰). این مرحله حدودا ۲۰ ثانیه می باشد.
- طویل سازی (Extention): از روی DNA الگو، Taq پلیمراز همانندسازی می کند. دمای این مرحله بالاتر از °۷۲ می باشد، زیرا آنزیم Taq پلیمراز در این دما بیشترین فعالیت را دارد.
زمان لازم برای انجام سه مرحله فوق در حدود ۲ دقیقه می باشد، که بدان یک سیکل PCR می گویند. در هر سیکل، تعداد نسخه های DNA دو برابر می شود و توالی مد نظر به طور توانی افزایش می یابد (در حدود یک میلیون برابر بعد از ۲۰ سیکل).
توجه: طول پرایمر مورد استفاده معمولا ۲۰ نوکلئوتید می باشد.
توجه: یک رشته پرایمر با خودش و یا با پرایمر رشته مقابل مکمل نباشد (چون در انجام PCR اختلال به وجود می آید).
توجه: Tm دو پرایمر بایستی نزدیک به هم باشد (Tm تعیین کننده دمای Anneling است. Tm دمایی است که ۵۰ درصد پرایمر به الگو می چسبد).
کاربرد های PCR
روش های PCR کاربرد های متنوعی دارد که در اینجا به برخی از آنها اشاره می شود:
- تکثیر یک قطعه معلوم: با استفاده از جفت پرایمر خاص، ژن مدنظر را می توان از بین انبوهی از ژن ها تکثیر کرد.
- کمک به کلون سازی و هیبریداسیون: در این روش به مقادیر زیادی DNA نیاز است که با PCR تهیه می شود.
- نوترکیبی DNA: پس از تکثیر DNA با PCR، قطعات ایجاد شده را می توان به پلاسمید باکتری یا DNA کروموزمی در یوکاریوت ها الحاق نمود و بدین ترتیب DNA نوترکیب ایجاد کرد.
- جداسازی توالی ژنتیکی دستکاری شده و یا جهش یافته: مثلا با استفاده از DNA ترانسپوزون هایی مثل عنصر P، جهش های افزودنی (Insertion) در ژنوم ایجاد می گردد. توالی ژنوم در جایگاه ورود ترانسپوزون، با PCR تکثیر شده و با توالی یابی شناخته می شود.
انواع PCR
PCR انواع مختلفی دارد که در اینجا فقط دو نوع آنها را بررسی می کنیم:
PCR معمولی: توضیحاتی که در بالا آمد.
RT-PCR: در این روش از mRNA به عنوان هدف استفاده می شود. در ابتدا، پرایمر dT به دم پلی A در انتهای mRNA 3′ متصل می شود. سپس RNA با استفاده از آنزیم RT به cDNA تبدیل شده و سپس cDNA حاصله توسط فن آوری PCR تکثیر می گردد. از این روش در تعیین میزان mRNA اولیه و بررسی دقیق تغییرات بیان ژن استفاده می شود.